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010-62817090氨基酸(amino acid, AA)含量測(cè)定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
動(dòng)物肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官,故尿中氨基酸的變化最能反應(yīng)肝、腎的生理狀態(tài)。另外,氨基酸還能反應(yīng)灼傷、傷寒等方面情況。植物體內(nèi)氨基酸含量對(duì)研究植物在不同條件下及不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期氮代謝變化、植物對(duì)氮素的吸收、運(yùn)輸、同化及營養(yǎng)狀況等有重要意義。
氨基酸的α -氨基可與水合茚三酮反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物,在 570 nm 有特征吸收峰;通過測(cè)定 570 nm
吸光度,來計(jì)算氨基酸含量。
產(chǎn)品名稱 | BH6012-100T/96S | Storage |
試劑一:液體 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑二:液體 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑三:粉劑 | 1 瓶 | 4℃ 避光 |
試劑四:粉劑 | 1 管 | 4℃ 避光 |
標(biāo)準(zhǔn)品:粉劑 | 1 瓶 | 4℃ 避光 |
說明書 | 1 份 |
試劑三臨用前加入 667μl 無水乙醇,蓋緊后充分混勻,再加入 9.333ml 蒸餾水混勻,避光保存。試劑四臨用前加 1ml 蒸餾水,充分溶解。
標(biāo)準(zhǔn)品臨用前加 10ml 蒸餾水,充分溶解。1μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液,4℃避光保存。
臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、無水乙醇、冰和蒸餾水。
1、按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進(jìn)行室溫勻漿,然后轉(zhuǎn)移到 1.5ml EP 管中,蓋緊后(防止水分散失)置于沸水浴提取 15 min;自來水冷卻后,8000g,,4℃離心 10min,上清液置冰上待測(cè)。
2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一),超聲波破碎細(xì)菌
或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
3、血清等液體:直接檢測(cè)。
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 570 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管:取EP 管,加入 10μl 蒸餾水,100μl 試劑二,100μl 試劑三和 10μl 試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫 15 min,冷卻后反復(fù)顛倒EP 管數(shù)次,于 570nm 測(cè)定吸光值,記為A 空白管。顯色后務(wù)必在 30min 內(nèi)測(cè)完。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取EP 管,加入 10μl 標(biāo)準(zhǔn)品,100μl 試劑二,100μl 試劑三和 10μl 試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫 15 min,冷卻后反復(fù)顛倒EP 管數(shù)次,于 570nm 測(cè)定吸光值,記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。顯色后務(wù)必在 30min 內(nèi)測(cè)完。
4. 測(cè)定管:取EP 管,加入 10μl 上清液,100μl 試劑二,100μl 試劑三和 10μl 試劑四,混勻后蓋緊瓶蓋(防止水分散失),置于沸水浴中保溫 15 min,冷卻后反復(fù)顛倒EP 管數(shù)次,于 570nm 測(cè)定吸光值,記為A 測(cè)定管。顯色后務(wù)必在 30min 內(nèi)測(cè)完。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。
a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1) 按蛋白濃度計(jì)算
氨基酸含量(μmol /mg prot)= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)]÷(V 樣×Cpr)
=1×(A 測(cè)定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白) ÷Cpr
(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算
氨基酸含量(μmol /g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)] ÷(V 樣總
÷V 樣)÷W
=1×(A 測(cè)定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白) ÷W
(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
氨基酸含量(μmol /104 cell)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)] ×
(V 樣總÷V 樣×細(xì)胞數(shù)量)
=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
(4) 按照液體體積計(jì)算
氨基酸含量(μmol /mL)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]÷V 樣
=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
C 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,1 μmol/mL;V 標(biāo)準(zhǔn)品:反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.01ml;W:樣品質(zhì)量, g;V 樣:反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積,0.01ml;V 樣總:樣品提取液總體積,1mL;;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。
(1) 按蛋白濃度計(jì)算
氨基酸含量(μmol /mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)] ÷(V 樣×Cpr)
=1×(A 測(cè)定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白) ÷Cpr
(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算
氨基酸含量(μmol /g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)]×(V 樣總÷V樣)÷W
=1×(A 測(cè)定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白) ÷W
(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
氨基酸含量(μmol /104 cell)= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)] ×
(V 樣總÷V 樣×細(xì)胞數(shù)量)
=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
(4) 按照液體體積計(jì)算
氨基酸含量(μmol /mL)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]÷V 樣
=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
C 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,1 μmol/mL;V 標(biāo)準(zhǔn)品:反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.01ml;W:樣品質(zhì)量, g;V 樣:反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積,0.01mL;V 樣總:樣品提取液總體積,1mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。
1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標(biāo)準(zhǔn)品均需臨用前配制,且避光保存,配制好未使用完的 4℃保存且 3
天內(nèi)使用完畢。
2. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,需先取 1-2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),如果測(cè)定的吸光值過高(高于 2.5),用蒸餾水稀釋后再測(cè)定。
3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)在 570nm 處無吸收峰,因此,570nm 處測(cè)定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。
4. *低檢出限為 100μmol/L。
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