Chromatrap ChIP相關(guān)試劑盒

Chromatrap公司技術(shù)領(lǐng)域。

Chromatrap為Porvair Science公司旗下的產(chǎn)品。該品牌產(chǎn)品主要為ChIP相關(guān)試劑盒。Chromatrap® ChIP 測定技術(shù)比傳統(tǒng)磁珠法的效率更高，原因是與蛋白質(zhì) A 或 G結(jié)合的固相多孔聚合物捕獲染色質(zhì)的效率更高。盡管同樣是使用離心柱法，但其優(yōu)勢是瓊脂糖珠或磁珠遠(yuǎn)不可相比的

介紹

在轉(zhuǎn)錄過程中，新生RNA可以與DNA模板鏈雜交，使非模板DNA鏈成為單鏈。這些結(jié)構(gòu)被稱為 R 環(huán)，它們的持續(xù)形成會(huì)對(duì)基因組完整性造成有害影響，這可能是由于未配對(duì)的單鏈 DNA （ssDNA）

盡管R環(huán)有可能在基因組的很大一部分上形成，但它們并不是轉(zhuǎn)錄的簡單結(jié)果。由于 DNA 序列、轉(zhuǎn)錄、拓?fù)浜腿旧|(zhì)環(huán)境的復(fù)雜相互作用，它們發(fā)生在特定的保守位點(diǎn)上 （切丹， 2016）。在具有未甲基化 CpG 島啟動(dòng)子的活性哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)編碼基因上，R 環(huán)富集在啟動(dòng)子和終止位點(diǎn)上并增強(qiáng)激活，并且它們與活性轉(zhuǎn)錄的組蛋白標(biāo)記相關(guān)，例如組蛋白 H3 賴氨酸 4 的單甲基化和三甲基化 （H3K4me1/3） 和 H3 乙?；?R-loops可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子，但它們也可以通過各種機(jī)制誘導(dǎo)不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄抑制.R環(huán)在激活或抑制中的這種“雙重"功能強(qiáng)烈表明，R環(huán)的形成在不同的情況下可以具有不同的作用和機(jī)制。

Polycomb 組（PcG） 蛋白是轉(zhuǎn)錄抑制的主要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，它們需要沉默胚胎干細(xì)胞 （ESC） 中富含 CpG 的發(fā)育調(diào)節(jié)基因，并維持在細(xì)胞承諾期間建立的基因表達(dá)模式 它們組裝在兩個(gè)主要的多亞基復(fù)合物中：Polycomb 抑制復(fù)合物 1 （PRC1） 和 PRC2。PRC1 和 PRC2 的催化組分分別為 RING1B 和 EZH2。RING1B 單泛素化賴氨酸 119 （H2Aub1） 中的組蛋白 H2A，EZH2 是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)賴氨酸 27 （H3K27me2/3） 中 H3 的二甲基化和三甲基化。

Polycomb介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制機(jī)制尚不wan全清楚。盡管它們在抑制中起作用，但小鼠胚胎干細(xì)胞 （mESC） 中的 PcG 靶基因顯示活性染色質(zhì)標(biāo)記 H3K4me3、RNA 聚合酶 II （Pol II） 和一般轉(zhuǎn)錄因子。Pol II 在 PcG 抑制基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)上檢測到，并表現(xiàn)出其 C 末端結(jié)構(gòu)域 （CTD） 的絲氨酸 5 磷酸化 （Ser5P），但不表現(xiàn)出 Ser2P 或 Ser7P，后者是生產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄延伸的標(biāo)志物.與沉穩(wěn)的Pol II的存在一致，在一些PcG靶標(biāo)

例如，轉(zhuǎn)錄本身起著一定的作用，因?yàn)閮H基因沉默就可以促進(jìn)PRC2募集到CpG島啟動(dòng)子.建議通過PRC2（Wang 等人，2004,Boyer 等人，2006 年）。然而，非經(jīng)典 PRC1（含有 RYBP 而不是 CBX）也可以通過 KDM2B 賴氨酸去甲基化酶

迄今為止，已經(jīng)在人類 ESC 中探索了 PcG 靶基因上 R 環(huán)的存在，其中基于生物信息學(xué)分析檢測到正相關(guān) （Ginno 等人2013 年），在分化的小鼠成纖維細(xì)胞（NIH 3T3 系）中，報(bào)告了負(fù)相關(guān) （Sanz 等人，2016 年).因此，目前尚不清楚PcG抑制機(jī)制是否以及如何受到R環(huán)的調(diào)節(jié)。

在這里，我們使用 mESC 來探索 R 環(huán)對(duì) PcG 抑制機(jī)制的貢獻(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn) R 環(huán)在 PcG 靶標(biāo)處形成，R 環(huán)丟失導(dǎo)致 PcG 募集不足和 Pol II 的鎮(zhèn)定狀態(tài)改變，導(dǎo)致基因去抑制。全基因組分析表明，R環(huán)的形成不是低轉(zhuǎn)錄水平的微不足道的結(jié)果，并且僅發(fā)生在PcG抑制基因的一個(gè)子集上。單獨(dú)敲除組成型 EZH2 （PRC2） 不足以影響 R 環(huán)或 RING1B （PRC1） 募集，也不會(huì)導(dǎo)致 R 環(huán)陽性基因的轉(zhuǎn)錄去抑制。相反，在這些情況下去除 R 環(huán)會(huì)導(dǎo)致基因激活并減少 RING1B 募集。在抑制 EZH2 催化活性后，R 環(huán)和 RING1B 可以抑制 PcG 靶標(biāo)。我們的研究結(jié)果揭示了 R 環(huán)和 PRC1 募集之間意想不到的相互作用，這有助于 PcG 抑制。

結(jié)果

R-環(huán)在 PcG 抑制基因上形成為了研究 R 環(huán)是否在 PcG 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默中發(fā)揮作用，我們使用 DNA-RNA 免疫沉淀（DIP 或 DRIP）分析 （Skourti-Stathaki 等人，2011 年,Ginno 等人，2012 年,Ginno 等人，2013 年,Skourti-Stathaki 等人，2014 年,Sanz 等人，2016 年） 在 mESC 中。我們選擇了五個(gè)先前表征的基因，即 Msx1、Math1、Nkx2.2、Nkx2.9 和 Gata4。這些基因具有注釋良好的 CpG 島啟動(dòng)子，在其啟動(dòng)子和編碼區(qū)富含 GC，并且在 mESC 中由 PRC1、PRC2 和穩(wěn)固的 Ser5P Pol II （Stock 等人，2007 年,Brookes 等人，2012 年,Ferrai 等人，2017 年).用 RNA-DNA 雜交特異性抗體 S9.6 （Boguslawski 等人，1986 年），并使用位于含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) （TSS） 的啟動(dòng)子 （P） 區(qū)域和基因體編碼 （C） 區(qū)域內(nèi)的引物分析純化的 DNA。作為陽性對(duì)照，我們使用了高表達(dá)的活性基因 β-肌動(dòng)蛋白，它在 P 和 C 區(qū)域形成 R 環(huán) （Skourti-Stathaki 等人，2011年,Skourti-Stathaki 等人，2014 年).作為陰性對(duì)照，我們使用不形成 R 環(huán)的活性基因 CyclinB1（Skourti-Stathaki 等人，2014 年）和在mESC中既不表達(dá)也不與PcG或Pol II相關(guān)的基因Myf5（Stock 等人，2007 年,Brookes 等人，2012 年).正如預(yù)期的那樣，R-環(huán)在β-肌動(dòng)蛋白上富集，但在CyclinB1或Myf5上未檢測到。值得注意的是，在所有五個(gè) PcG 抑制基因的 P 和 C 區(qū)域，R 環(huán)都特異性富集。

以下為Chromatrap公司熱銷產(chǎn)品